Перевод статьи о гене HES7, связанном с короткими хвостами у азиатских домашних кошек.

Перевод выполнен Евгением Торбиным специально для сайта КурбобКлуб.ру

Полногеномное секвенирование генома идентифицирует миссенс-мутацию HES7, связанную с короткими хвостами у азиатских домашних кошек.

Whole Genome Sequencing Identifies a Missense Mutation in HES7 Associated with Short Tails in Asian Domestic Cats

www.nature.com/scientificreports

SCIENTIFIC REPORTS

ОТКРЫТЫЙ

Получено: 04 мая 2016 г.

Принято: 19 июля 2016 г.

Опубликовано: 25 августа 2016 г.

Сяо Сюй, Синь Сунь, Сюэ-Сун Ху, Янь Чжуан, Юэ-Чэнь Лю, Хао Мэн, Линь Мяо, Хэ Юй и Шу-Цзинь Ло

Домашние кошки демонстрируют богатое разнообразие морфологии хвоста и служат отличной моделью для изучения развития и эволюции хвостов позвоночных. Кошки с укороченными и изогнутыми хвостами были впервые зарегистрированы на Малайском архипелаге Чарльзом Дарвином в 1868 году и остаются довольно распространенными сегодня в Юго-Восточной и Восточной Азии. Чтобы выяснить генетическую основу коротких хвостов у азиатских кошек, мы построили родословную из 13 кошек, расщепляющихся по этому признаку, с основателем из южного Китая и выполнили картирование сцепления на основе данных полногеномного секвенирования этой родословной. Признак короткого хвоста был картирован на область 5.6 Mb на хромосоме E1, в пределах которой замена c.5T>C в гене HES7, связанном с сегментацией сомитов, была идентифицирована как причинная мутация, приводящая к миссенс-замене (p.V2A). Валидация у 245 неродственных кошек подтвердила корреляцию между HES7-c.5T>C и китайскими короткохвостыми дикими кошками, а также породой Японский бобтейл, что указывает на общую генетическую основу признаков. Кроме того, некоторые из наших образцов кошек с изогнутым хвостом не могли быть объяснены ни HES7, ни T-box, связанным с породой Мэнкс, что предполагает по меньшей мере три независимых события в эволюции домашних кошек, приведших к признакам короткого хвоста.

Большинство видов позвоночных, за заметным исключением людей и обезьян, обладают видимым хвостом на протяжении всей своей жизни. Хвост животного является важным придатком туловища и играет адаптивную роль в передвижении, равновесии, общении, терморегуляции и даже накоплении энергии¹. У позвоночных хвосты значительно различаются по цвету, размеру, форме и подвижности и представляют разные эволюционные истории, включая многочисленные независимые события укорочения или потери хвоста в различных линиях. Понимание генетических причин внутривидового полиморфизма длины хвоста было бы одним из важных шагов к выяснению механизмов, лежащих в основе развития и эволюции хвостов. В лабораторных мышах генетические исследования развития осевого скелета выявили множественные гены и мутации, участвующие в развитии хвостовых позвонков, которые имеют плейотропные эффекты на фертильность, сомитогенез и мейотическую рекомбинацию, тем самым проливая свет на эволюцию позвоночных²⁻⁵. Однако, учитывая огромное разнообразие морфологии хвоста, обнаруженное у животных, одни только мыши могут быть не в состоянии охватить весь спектр эволюционного разнообразия хвостов млекопитающих. Таким образом, исследование немодельных видов необходимо для получения полного понимания лежащих в основе механизмов.

Богатое фенотипическое разнообразие возникло у домашней кошки (Felis catus) с момента ее одомашнивания на Ближнем Востоке примерно 10 000 лет назад. Заметно отличаясь от своего дикого предка F. silvestris, домашние кошки оказались важной животной моделью для изучения взаимосвязей генотип-фенотип, а также сравнительной биомедицинской моделью для различных гомологов заболеваний человека⁷⁻¹². Домашняя кошка демонстрирует несколько вариаций признаков хвоста, среди которых полиморфизм длины является наиболее заметным. Кошки с укороченными хвостами были впервые задокументированы в Юго-Восточной Азии, простирающейся до южного Китая, и, вероятно, существовали в течение долгого времени до появления большинства современных пород кошек, как записал в 1868 году Чарльз Дарвин¹³: «На обширной территории, а именно на Малайском архипелаге, в Сиаме, Пегу и Бирме, у всех кошек укороченные хвосты, примерно вдвое меньше нормальной длины, часто с чем-то вроде узла на конце». В южном Китае короткохвостых кошек называют «хвост Цилиня» (в честь мифического существа, известного в китайской и других восточноазиатских культурах) и традиционно считают символом удачи и богатства¹⁴,¹⁵. Помимо уменьшения длины, хвосты этих кошек часто имеют изгибы, признак, также называемый «изогнутый хвост»¹⁶.

Короткохвостые домашние кошки широко распространены в Юго-Восточной Азии и южном Китае, и они демонстрируют переменное укорочение и изгибы, которые можно в целом разделить на три категории: (1) «незначительный изгиб», который описывает хвост, показывающий лишь небольшое укорочение (примерно 25 см в длину) с изгибом в дистальной области (Рис. 1A); (2) «средний изгиб», который описывает хвост, показывающий заметное усечение (примерно 10–20 см в длину) с изгибами в проксимальной и/или дистальной хвостовой области (Рис. 1B); и (3) «экстремальный изгиб», который описывает бобтейл с сильным усечением (менее 10 см в длину) и множественными изгибами (Рис. 1C). Кошки с хвостами «незначительный изгиб» или «средний изгиб» встречаются чаще, чем кошки с хвостами «экстремальный изгиб». Несмотря на деформацию, такие укороченные и изогнутые хвосты создают небольшой физиологический дефицит, влияющий на выживаемость и воспроизводство, о чем свидетельствует сохранение и распространенность признака как у диких, так и у домашних кошек в Юго-Восточной и Восточной Азии. Эмпирическая практика разведения показала, что котенок с изогнутым хвостом всегда рождается по крайней мере от одного родителя с изогнутым хвостом, и что некоторые из его однопометников, если не все, обычно демонстрируют вариабельную длину и изгибы хвоста, что предполагает, что короткий хвост у азиатских кошек является доминантным признаком, вызванным мутацией(ями) с переменной степенью экспрессивности. Однако, несмотря на широкое географическое распространение, долгую историю распространенности и культурное значение короткохвостой кошки в Азии, ее основная генетическая причина остается неясной.

Аномальные длины хвостов также признаны по меньшей мере у пяти современных пород кошек в мире, включая Японский бобтейл, Мэнкс, Американский бобтейл, Пиксибоб и Курильский бобтейл⁷,¹⁷. Предыдущее генетическое исследование связало признак короткого хвоста/бесхвостости у Мэнкса и нескольких пород кошек-бобтейлов с мутациями в гене T-box, гомозиготы или компаундные гетерозиготы которых приводят к эмбриональной летальности⁷. Ген T-box кодирует фактор транскрипции семейства T-box Brachyury, который специфически экспрессируется в нотохорде и ранних клетках мезодермы и играет важную роль в формировании мезодермы и дифференцировке нотохорды¹⁸. Мутации в T-box также вызывают деформации хвоста у лабораторных мышей и собак¹⁸,¹⁹. Однако было показано, что ген T-box не связан с признаком короткого хвоста у Японского бобтейла, что предполагает, что по крайней мере один дополнительный локус определяет полиморфизм длины хвоста у домашних кошек⁷.

В отличие от других короткохвостых кошек европейского или американского происхождения, Японский бобтейл строго отбирается по признаку тонкого короткого хвоста и демонстрирует фиксированный признак бобтейла, что предполагает генетическую однородность по причинному локусу¹⁵. Хвост Японского бобтейла составляет примерно 10 см в длину в вытянутом состоянии и не демонстрирует значительной вариации длины, и он состоит из множественных изгибов или узлов, скручивающих его в форму помпона. Генетическое скрещивание между Японским бобтейлом и кошкой с нормальной длиной хвоста продемонстрировало доминантное наследование локуса бобтейла, и было обнаружено, что потомство с коротким хвостом демонстрирует изгибы и вариации длины хвоста²⁰. Учитывая морфологическое и наследственное сходство Японского бобтейла с короткохвостыми домашними кошками в Юго-Восточной Азии и южном Китае, разумно предположить, что они могут иметь общую генетическую основу, и родоначальник породы Японский бобтейл мог изначально быть из Юго-Восточной Азии или Китая.

В этом исследовании мы построили двухпоколенную родословную от дикой самки с изогнутым хвостом из южного Китая, скрещенной с домашним самцом с нормальным хвостом. Мы выполнили полногеномное картирование сцепления и полногеномное секвенирование на основе родословной и идентифицировали миссенс-замену в HES7, которая была связана с признаком изогнутого/короткого хвоста у кошек Юго-Восточной Азии и южного Китая. Эти результаты дают новое понимание эволюции домашней кошки и происхождения некоторых современных пород кошек.

Результаты

Изучение мутаций T-box у короткохвостых кошек из южного Китая. Поскольку T-box был наиболее вероятным геном-кандидатом, его кодирующие экзоны были амплифицированы и секвенированы у 20 кошек с изогнутым хвостом и 20 кошек дикого типа из южного Китая. Было обнаружено четыре ОНП (однонуклеотидных полиморфизма), включая три синонимичные замены (c.270C>T, c.324G>A, c.345C>G) и одну несинонимичную замену (c.1079C>T), приводящую к замене треонина на метионин в аминокислотном остатке 360 (p.T360M). Хотя p.T360M встречается в консервативном сайте, этот вариант распространен в популяции кошек в южном Китае и не связан с целевым локусом (p=1,00). Ни одна из четырех мутаций со сдвигом рамки считывания, которые, как известно, вызывают бесхвостость или короткие хвосты у кошки Мэнкс (c.998delT, c.998_1014dup17delGCC, c.1169delC и c.1199delC), не была обнаружена у этих азиатских короткохвостых кошек⁷, что подтверждает, что генетические основы, лежащие в основе короткохвостых кошек европейского и азиатского происхождения, различны.

Построение родословной и фенотипирование хвоста. Была построена двухпоколенная родословная кошек (N=13) с расщеплением по признаку изогнутого/короткого хвоста, в которой, согласно записям о разведении, самка, как предполагалось, была гетерозиготна по признаку изогнутого хвоста (средний изгиб), а самец был дикого типа. Было рождено два помета из 11 особей поколения F1, включая трех кошек с нормальным хвостом и восемь короткохвостых кошек (Рис. 2A). Трое из восьми мутантных потомков относились к категории «незначительный изгиб», а остальные пять были отнесены к категории «средний изгиб». Наблюдаемое расщепление признака хвоста в этой родословной (8:3) не указывало на значительное отклонение от ожидаемого соотношения при аутосомно-доминантном наследовании (\chi^{2}=2,273, 1df; p=0,1317). Наблюдаемые морфологические вариации среди потомков с изогнутым хвостом также предполагали неполное доминирование мутации. Этот результат согласуется с предыдущим генетическим исследованием Японского бобтейла²⁰.

Все особи в родословной, за исключением одного мертворожденного котенка, были подвергнуты рентгенографии для точного изучения фенотипов хвоста. Кошки дикого типа имели 22 хвостовых позвонка без признаков деформации (Таблица S1). Изогнутохвостая самка и все потомки демонстрировали укорочение хвоста, с числом хвостовых позвонков от 14 до 21, и они имели от одного до четырех хвостовых полупозвонков (Таблица S1). Кроме того, пять из восьми изогнутохвостых особей показали блокированные хвостовые позвонки (сращение позвонков, Таблица S1). В целом, результаты радиологии продемонстрировали, что наблюдаемые фенотипы изогнутого хвоста у азиатских домашних кошек являются комбинированным эффектом различных деформаций хвостовых позвонков, включая уменьшение числа хвостовых позвонков, полупозвонки и блокированные позвонки. Мальформация хвостовых позвонков у изогнутохвостых кошек в Юго-Восточной и Восточной Азии была аналогична таковой у Японского бобтейла²⁰.

Анализ сцепления признака изогнутого хвоста. Полногеномный анализ сцепления был выполнен на основе родословной кошек с изогнутым хвостом. 13 кошек в родословной были секвенированы со средней глубиной 11-кратного покрытия на особь (Таблица S2). Всего было найдено 29002933 ОНП/инделов, из которых 9 413 987 ОНП/инделов, которые покрывали всех кошек, были использованы для последующего анализа. Мы обнаружили 6656 ОНП/инделов, которые охватывали четыре отдельные области генома на хромосомах B1, B3, C1 и E1 и показали самый сильный сигнал сцепления с короткими/изогнутыми хвостами (LOD=3,01, Рис. 2B). Однако сигналы, обнаруженные на кошачьих хромосомах B1 (4 ОНП), B3 (2 ОНП) и C1 (3 ОНП), были результатом трех чрезвычайно коротких гаплотипических блоков (<10 Кб) на каждой хромосоме, которые, вероятно, были вызваны горячими точками геномной рекомбинации и, таким образом, были отброшены как ложные срабатывания. Напротив, почти все (>99%) значимых маркеров (6647 ОНП) были расположены на хромосоме E1 и определяли гаплотипический блок 5,6 Мб (ChrE1: 183,971–5,815,703) в полном неравновесии по сцеплению (LD) с признаком короткого хвоста в родословной, что представляет собой истинный сигнал генетического сцепления.

HES7 связан с изогнутыми/короткими хвостами у азиатских кошек. В картированном интервале, связанном с признаком изогнутого/короткого хвоста, было 144 аннотированных гена, 11 из которых участвуют в развитии скелета у мышей (Таблица S3). Чтобы идентифицировать причинную мутацию/мутации, мы проанализировали генетические вариации, включая как ОНП, так и инделы, в пределах генов-кандидатов на основе данных полногеномного ресеквенирования родословной кошек. В то время как инделов не было обнаружено в кодирующей области генов-кандидатов, было идентифицировано 2907 ОНП, из которых 68 соответствовали доминантной модели наследования изогнутых хвостов в родословной и были дополнительно проанализированы. Двенадцать из 68 ОНП были несинонимичными заменами, среди которых только две (c.2969G>C в ZBTB4 и c.5T>C в HES7) вызывали изменения аминокислот в эволюционно консервативных сайтах остатков и считались вероятными мутациями (Таблица S4). Оба варианта-кандидата были протестированы у 16 кошек с изогнутым хвостом и 16 кошек с нормальным хвостом. ZBTB4 c.2969G>C не был связан с изогнутыми хвостами (p=0,600) и был исключен, тогда как HES7 c.5T>C показал сильный сигнал ассоциации с признаком изогнутого хвоста (p=3,33E-9), считаясь причинной мутацией. HES7 кодирует основной транскрипционный репрессор со спираль-поворот-спиральной структурой, регулирующий сегментацию сомитов через путь Notch²¹⁻²³. Было показано, что мутации в HES7 связаны со спондилокостальным дизостозом (SCD), нарушением развития осевого скелета, характеризующимся обширными полупозвонками и аномалиями ребер у людей и собак²⁴⁻²⁸, а HES7-нокаутные мыши демонстрируют изогнутый хвост в дополнение к мальформации позвоночника и ребер²³,²⁸. c.5T>C вызывает миссенс-замену валина на аланин (p.V2A) в эволюционно консервативном сайте аминокислотного остатка в белке HES7 (Рис. 3). Прогнозы влияния аминокислотной замены на функцию белка, сделанные SIFT²⁹,³⁰ и PolyPhen³¹, предполагали, что p.V2A может быть вредным для белка HES7. Следовательно, c.5T>C в HES7, вероятно, является причинной мутацией, ответственной за изогнутые/короткие хвосты у азиатских домашних кошек.

Мы дополнительно подтвердили мутацию HES7 в расширенной выборке из 245 неродственных кошек, включая 126 диких кошек из Азии и 119 породистых кошек (Таблица 1). Одна из 59 диких кошек с изогнутым хвостом из южного Китая была гомозиготна по замене c.5T>C (C/C), а 38 были гетерозиготными, несущими одну копию мутантного аллеля (T/C), тогда как 20 не несли мутации (T/T). Тем не менее, ни одной мутантной особи не было обнаружено среди 174 контрольных кошек с нормальным хвостом, которые все были гомозиготными по аллелю дикого типа (T/T, Таблица 1). Результаты показывают, что мутация HES7 c.5T>C сильно связана с короткими/изогнутыми хвостами азиатских домашних кошек (p=7,821E-30) в соответствии с доминантным типом наследования, хотя могут быть задействованы и другие мутации(ии). Мы дополнительно секвенировали всю кодирующую область HES7 и T-box у 20 кошек с изогнутым хвостом, гомозиготных по аллелю дикого типа c.5T, но не идентифицировали ни одного варианта, связанного с их изогнутыми хвостами, что предполагает, что существует по крайней мере один локус, кроме HES7 или T-box, который приводит к распространенным изогнутым/коротким хвостам у домашних кошек из южного Китая и Юго-Восточной Азии. Кроме того, мы генотипировали мутацию HES7 у 12 японских бобтейлов, все из которых были гомозиготными, что указывает на то, что признак короткого хвоста у японского бобтейла, вероятно, фиксирован с мутацией HES7 c.5T>C (p=4,014E-19). Примечательно, что особи, гомозиготные по варианту HES7, всегда относились к категории «экстремальный изгиб», как наблюдалось как у азиатских кошек с изогнутым хвостом, так и у породы Японский бобтейл, тогда как гетерозиготы характеризовались как «незначительный изгиб» или «средний изгиб» (Таблица 1), что предполагает дозовый эффект HES7 c.5T>C на морфологию хвоста.

Обсуждение

HES7 является ключевым компонентом пути Notch, который играет важную роль в формировании сомитов у позвоночных²¹⁻²³. HES7 специфически экспрессируется в пресомитной мезодерме (PSM), несегментированной мезенхиме эмбриона позвоночных, и непосредственно нацелен сигнальным путем Notch²¹⁻²³. Подавляемая своим собственным кодируемым белком, транскрипция HES7 формирует петлю отрицательной обратной связи и осциллирует в 2-часовом цикле, синхронизированном с образованием нового сомита у мышей²¹,²³. Транскрипционное подавление белков семейства HES функционирует посредством двух механизмов: 1) белки HES связываются непосредственно с N-box (CACNAG) через свой основной домен и рекрутируют белки семейства Groucho/TLE (ко-репрессор) к промотору целевого гена; 2) белки HES гетеродимеризуются с белком E47 через свои домены HLH, тем самым предотвращая связывание E47 с E-box (CANNTG) и активацию транскрипции³².

Мутации HES7 вызывают спондилокостальный дизостоз (SCD), редкую врожденную аномалию развития осевого скелета у людей. На сегодняшний день у людей с SCD было идентифицировано по меньшей мере пять мутаций HES7, включая четыре миссенс-мутации (p.R25W, p.I58V, p.D142Y, p.D186Y) и один сдвиг рамки считывания (p.R137QfsX42)²⁴⁻²⁶,²⁸. Мутация p.R25W расположена в пределах доменов bHLH и нарушает способность HES7 связываться с ДНК и образовывать гетеродимер с E47 in vitro²⁵. Неожиданно, аналогичные функциональные дефекты HES7 также наблюдались у вариантов, вызванных миссенс-мутациями (p.D142Y и p.D186Y) за пределами доменов bHLH in vitro, что предполагает существенную роль остатков не-bHLH домена в поддержании функции HES7²⁶,²⁸. Хотя вариант изогнутого хвоста (p.V2A), обнаруженный у кошек, расположен выше доменов bHLH, он представляет собой изменение аминокислоты в эволюционно консервативном сайте и может влиять на эффект транскрипционной регуляции HES7, как наблюдалось в случаях мутаций p.D142Y и p.D186Y при SCD у человека. Примечательно, что мутации влияющие на стабильность HES7, также нарушают его нормальный осцилляторный цикл, что приводит к аномальной сегментации сомитов у мышей³³. В качестве альтернативы, мутация p.V2A может влиять на стабильность HES7 путем увеличения или уменьшения его периода полураспада, впоследствии нарушая осцилляторный цикл транскрипции HES7. Необходимы дальнейшие функциональные исследования для подтверждения влияния p.V2A на HES7.

Фенотип	N	Генотип (HES7 c.5T > C)
		+/+ (T/T)	+/mut (T/C)	mut/mut (C/C)
Кошки с коротким/изогнутым хвостом
незначительный изгиб, дикие	13	6	7	0
средний изгиб, дикие	45	14	31	0
экстремальный изгиб, дикие	1	0	0	1
Японский бобтейл, порода	12	0	0	12
Кошки дикого типа
дикие	67	67	0	0
породистые	107	107	0	0
Всего	245	194	38	13

Таблица 1. Корреляция между фенотипами хвоста и генотипами HES7 у азиатских домашних кошек.

В нашем исследовании домашние кошки с одной копией варианта HES7-p.V2A всегда демонстрировали изогнутые хвосты, хотя степень варьировалась, от «незначительного изгиба» до «среднего изгиба», что соответствует доминантному типу наследования и полной пенетрантности (Таблица 1). Этот результат отличается от случаев у людей и мышей, у которых сообщалось о неполной пенетрантности некоторых доминантных мутаций HES7²³,²⁸. Кроме того, сообщалось о высокой частоте младенческой смертности для гомозиготных мутантов HES7 у людей, мышей и собак²³,²⁴,²⁷,²⁸. Эти мутации либо вызывали сдвиги рамки считывания (у людей и собак), либо нокаутные аллели (у мышей), что приводило к потере функции HES7²³,²⁴,²⁷,²⁸. У кошек, за исключением аномалии хвоста, дикие кошки, гетерозиготные или гомозиготные по p.V2A HES7, выглядят нормальными и не испытывают очевидных проблем со здоровьем в городской или сельской среде, что предполагает, что p.V2A может в первую очередь влиять только на хвостовую часть позвонков, не полностью подавляя функцию HES7.

Приблизительно треть кошек с изогнутым хвостом из Китая, обследованных в этом исследовании, все отнесенные к категориям «незначительный изгиб» или «средний изгиб», не несли ни одной из известных генетических вариаций в HES7 или T-box, которые связаны с короткими хвостами, что указывает на существование дополнительного гена(ов), способствующего появлению азиатских кошек с изогнутым/коротким хвостом. В нашей выборке эти кошки с изогнутым хвостом с неизвестной генетической причиной были фенотипически схожи с гетерозиготами HES7 p.V2A, включая особей как в категории «незначительный изгиб», так и в категории «средний изгиб» в аналогичном соотношении (p=0,339, Таблица 1). Тем не менее, все короткохвостые кошки, отнесенные к категории «экстремальный изгиб» в нашем наборе образцов, были гомозиготными по варианту HES7. Таким образом, в эволюционной истории домашних кошек произошло по меньшей мере три независимых события, которые привели к появлению коротких и/или изогнутых хвостов. Дальнейшие исследования с расширенной выборкой из Юго-Восточной Азии и Китая будут необходимы для выяснения генетических причин, происхождения и распространенности множественных мутаций изогнутого хвоста у азиатских домашних кошек.

Японский бобтейл — это современная порода кошек, которая была специально отобрана по признаку «бобтейла», у которой самое дальнее вытягивание хвостовой кости от тела не должно превышать 10 см. Он был официально зарегистрирован как порода в 1960-х годах в США, от основателей, импортированных из Японии, но до этого естественно встречающиеся короткохвостые кошки существовали на островах Японии на протяжении веков¹⁵. Считается, что домашние кошки в Японии прибыли из Китая в начале шестого века, вероятно, вместе с буддийскими монахами, которые использовали кошек для отпугивания крыс от своих свитков из рисовой бумаги¹⁵. Однако было неясно, присутствовал ли признак «бобтейла» уже у изначально завезенных кошек из Китая или возник из впоследствии процветающей популяции кошек в Японии. В этом исследовании мы продемонстрировали, что фенотипы изогнутого хвоста, распространенные среди уличных кошек южного Китая и у Японского бобтейла, оба вызваны мутацией HES7 p.V2A, что предполагает, что один и тот же генетический признак является общим для двух штаммов.

Во время подготовки этого рукописи независимое исследование сообщило, что признак бобтейла Японского бобтейла связан с той же мутацией HES7, что дает дополнительную поддержку результатам этого исследования³⁴.

Материалы и Методы

Родословная. Была создана родословная кошек, расщепляющихся по признаку короткого/изогнутого хвоста, путем скрещивания самки с изогнутым хвостом с самцом с нормальным хвостом. Самка кошки была получена из Гуанчжоу, провинция Гуандун, в южном Китае и, по записям заводчика, скорее всего, была гетерозиготна по признаку короткого/изогнутого хвоста. Самец кошки был американской короткошерстной кошкой, купленной на рынке домашних животных в Пекине, Китай. От самца и самки родилось два помета из 11 котят (Рис. 2A). Когда котята F1 достигли возраста трех месяцев, было выполнено обследование фенотипа хвоста для каждой особи путем визуального осмотра и пальпации. За исключением мертворожденного котенка, все особи в родословной были обследованы с помощью рентгенографии таза и хвоста в Ветеринарной учебной больнице Китайского сельскохозяйственного университета. Родословная поддерживалась в вольере для животных Пекинского университета (PKU) и/или у частных владельцев, которые взяли кошек из родословной. Все обращение с животными и экспериментальные протоколы были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) PKU, и методы были выполнены в соответствии с соответствующими руководящими принципами.

Отбор образцов и экстракция ДНК. Цельная антикоагулянтная кровь 12 живых кошек и образец ткани от мертворожденного котенка были собраны из родословной короткохвостых кошек PKU. Щечные образцы от неродственных особей были собраны от домашних или диких домашних кошек, обитающих в различных регионах Китая, включая 59 короткохвостых кошек из Гуандуна и 67 кошек дикого типа из провинций Гуандун (N=13) Хунань (N=16), Цзянсу (N=10), Чжэцзян (N=13) и Цзянси (N=5) и города Пекин (N=10). Кроме того, образцы ДНК от 119 кошек 21 породы (Таблица S5) были предоставлены Лабораторией геномного разнообразия, NCI-Frederick, Мэриленд, США, включая 12 Японских бобтейлов. Фенотипы длины и морфологии хвоста, связанные с каждой отобранной кошкой, были визуально осмотрены и недвусмысленно записаны. ДНК из крови, ткани и щечных образцов была извлечена с использованием набора DNeasy Blood and Tissue Kit (QIAGEN) в соответствии с инструкциями производителя.

Секвенирование гена T-box. Сообщалось, что мутации T-box вызывают бесхвостость и/или более короткую длину хвоста у Мэнкса, таким образом, служа геном-кандидатом для признака короткого хвоста кошек Восточной и Юго-Восточной Азии. Все кодирующие экзоны гена T-box были амплифицированы у 20 короткохвостых и 20 кошек дикого типа из южного Китая. Праймеры для амплификации сегментов T-box (Таблица S6) были разработаны на основе референсного генома кошки (Felis catus 8.0) с использованием онлайн-программы Primer3³⁵,³⁶. Реакции ПЦР и последующие реакции секвенирования проводились в соответствии с ранее описанными процедурами³⁷.

Полногеномное секвенирование и вызов ОНП. Полногеномное секвенирование было проведено у всех 13 особей из родословной в Novogene Corporation, Пекин. Для каждого образца была построена библиотека секвенирования со средним размером вставки 250 п.н. и загружена в секвенатор Illumina Hiseq 2000. Было получено приблизительно 30 Гб высококачественных данных в виде парно-концевых прочтений по 100 п.н., достигая в среднем 11-кратного покрытия генома для каждой особи. Адаптерные последовательности на обоих концах прочтений были обрезаны с помощью Cutadapt 1.1³⁸. Обработанные прочтения были впоследствии выровнены по референсному геному кошки (Felis catus 8.0) с помощью Burrows-Wheeler Aligner 0.6.1 со стандартными параметрами³⁹. Дупликации ПЦР были удалены из выравниваний. Вызов ОНП и небольших инделов был выполнен SAMTOOLS 1.2 в соответствии со стандартной процедурой⁴⁰. ОНП и небольшие инделы с низким качеством (GQ<20) были отфильтрованы.

Анализ картирования сцепления. ОНП и инделы, охватывающие всех 13 кошек в родословной, были выбраны для полногеномного картирования сцепления. Параметрический анализ сцепления по доминантной модели был выполнен с использованием MERLIN 1.1.2⁴¹. Девять особей с изогнутым/коротким хвостом были установлены как пораженные образцы, а четыре особи дикого типа были установлены как непораженные образцы. Частота аллеля заболевания предполагалась равной 1% с полной пенетрантностью. Оценка LOD была рассчитана для каждого ОНП или индела на 18 аутосомных хромосомах кошки, и пороговое значение LOD было условно установлено на уровне 3 для сигналов сцепления между ОНП/инделом и признаком изогнутого/короткого хвоста. Геномные области с ОНП/инделами с оценками LOD больше 3 были выбраны для дальнейшего анализа гаплотипов и сцепления признака изогнутого/короткого хвоста в родословной кошек.

Идентификация предполагаемых причинных мутаций. Гены, расположенные в связанной области признака изогнутого/короткого хвоста, считались генами-кандидатами. ОНП и инделы из связанной области были проанализированы на предмет предполагаемых мутаций, связанных с коротким/изогнутым хвостом у азиатских кошек. ОНП/инделы из некодирующей области были сначала исключены, а те, которые не соответствовали доминантной модели наследования в родословной кошек с изогнутым хвостом, были дополнительно исключены. ОНП/инделы, вызывающие изменения аминокислот из оставшихся ОНП/инделов в пределах кодирующих областей, были выбраны и исследованы на предмет эволюционных ограничений каждого затронутого сайта аминокислотного остатка. Только несинонимичные замены в эволюционно консервативных сайтах и инделы, вызывающие сдвиг рамки считывания или затрагивающие консервативные аминокислотные остатки, считались предполагаемыми мутациями. Возможные эффекты предполагаемых мутаций на соответствующий белок были предсказаны с помощью SIFT и PolyPhen²⁹⁻³¹.

Валидация причинной мутации. Предполагаемые мутации были сначала протестированы у 16 кошек с изогнутым хвостом и 16 кошек с нормальным хвостом. Мутации, не показавшие сигнала ассоциации с изогнутыми хвостами, были отброшены. Оставшаяся мутация(ии) была подтверждена в большой коллекции неродственных кошек с подтвержденными фенотипами хвоста, включая 59 кошек с изогнутым хвостом и 67 кошек с нормальным хвостом из Китая и еще 119 породистых кошек (Таблица S5). Полные кодирующие экзоны HES7 и T-box были дополнительно секвенированы у 20 кошек с изогнутым хвостом, которые несли два аллеля дикого типа в предполагаемом локусе. Наборы праймеров для амплификации экзонов HES7 (Таблица S6) были разработаны на основе сборки генома кошки (Felis catus 8.0). Реакции ПЦР и последующие реакции секвенирования проводились в соответствии с ранее описанными процедурами³⁷.

Источники

1. Hickman, G. C. The mammalian tail: a review of functions. Mamm Rev 9, 143-157 (1979).
2. Beck, C. M. Development of the vertebrae tailbud. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol 4, 33-44 (2015).
3. Casaca, A., Santos, A. C. & Mallo, M. Controlling Hox gene expression and activity to build the vertebrate axial skeleton. Dev Dyn 243, 24-36 (2014).
4. Teven, C. M., Farina, E. M., Rivas, J. & Reid, R. R. Fibroblast growth factor (FGF) signaling in development and skeletal diseases. Genes Dis 1, 199-213 (2014).
5. Wahi, K., Bochter, M. S. & Cole, S. E. The many roles of Notch signaling during vertebrate somitogenesis. Semin Cell Dev Biol 49, 68-75 (2016).
6. Driscoll, C. A. et al. The Near Eastern origin of cat domestication. Science 317, 519-523 (2007).
7. Buckingham, K. J. et al. Multiple mutant T alleles cause haploinsufficiency of Brachyury and short tails in Manx cats. Mamm Genome 24, 400-408 (2013).
8. Eizirik, E. et al. Molecular genetics and evolution of melanism in the cat family. Curr Biol 13, 448-453 (2003).
9. Gandolfi, B. et al. The naked truth: Sphynx and Devon Rex cat breed mutations in KRT71. Mamm Genome 21, 509-515 (2010).
10. Kaelin, C. B. et al. Specifying and sustaining pigmentation patterns in domestic and wild cats. Science 337, 1536-1541 (2012).
11. Kehler, J. S. et al. Four independent mutations in the feline fibroblast growth factor 5 gene determine the long-haired phenotype in domestic cats. J Hered 98, 555-566 (2007).
12. Lyons, L. A. et al. Aristaless-Like Homeobox protein 1 (ALX1) variant associated with craniofacial structure and frontonasal dysplasia in Burmese cats. Dev Biol 409, 451-458 (2016).
13. Darwin, C. The variation of animals and plants under domestication, (John Murray, London, 1868).
14. Huang, H. & Wang, C. Mao Yuan, Mao Cheng, (Zhejiang People's Fine Arts Publishing House, Zhejiang, China, 2016).
15. Helgren, J. A. Barron's encyclopedia of cat breeds: a complete guide to the domestic cats of North America, (Barron's Educational Series, Inc., New York, 1997).
16. Searle, A. G. A study of variation in Singapore cats. J Genet 56, 111-127 (1959).
17. Vella, C. M., Shelton, L. M., McGonagle, J. J. & Stanglein, T. W. Robinson's Genetics for Cat Breeders & Veterinarians (Fourth Edition), (Elsevier Health Sciences, London, 1999).
18. Beddington, R. S., Rashbass, P. & Wilson, V. Brachyury-a gene affecting mouse gastrulation and early organogenesis. Dev Suppl. 157-165 (1992).
19. Haworth, K. et al. Canine homolog of the T-box transcription factor T; failure of the protein to bind to its DNA target leads to a short-tail phenotype. Mamm Genome 12, 212-218 (2001).
20. Pollard, R. E., Koehne, A. L., Peterson, C. B. & Lyons, L. A. Japanese Bobtail: vertebral morphology and genetic characterization of an established cat breed. J Feline Med Surg 17, 719-726 (2015).
21. Bessho, Y., Hirata, H., Masamizu, Y. & Kageyama, R. Periodic repression by the bHLH factor Hes7 is an essential mechanism for the somite segmentation clock. Genes Dev 17, 1451-1456 (2003).
22. Bessho, Y., Miyoshi, G., Sakata, R. & Kageyama, R. Hes7: a bHLH-type repressor gene regulated by Notch and expressed in the presomitic mesoderm. Genes Cells 6, 175-185 (2001).
23. Bessho, Y. et al. Dynamic expression and essential functions of Hes7 in somite segmentation. Genes Dev 15, 2642-2647 (2001).
24. Sparrow, D. B. et al. Mutation of HES7 in a large extended family with spondylocostal dysostosis and dextrocardia with situs inversus. Am J Med Genet A 161A, 2244-2249 (2013).
25. Sparrow, D. B., Guillen-Navarro, E., Fatkin, D. & Dunwoodie, S. L. Mutation of Hairy-and-Enhancer-of-Split-7 in humans causes spondylocostal dysostosis. Hum Mol Genet 17, 3761-3766 (2008).
26. Sparrow, D. B., Sillence, D., Wouters, M. A., Turnpenny, P. D. & Dunwoodie, S. L. Two novel missense mutations in HAIRY-AND- ENHANCER-OF-SPLIT-7 in a family with spondylocostal dysostosis. Eur J Hum Genet 18, 674-679 (2010).
27. Willet, C. E. et al. Canine disorder mirrors human disease: exonic deletion in HES7 causes autosomal recessive spondylocostal dysostosis in miniature Schnauzer dogs. PLoS One 10, e0117055 (2015).
28. Sparrow, D. B. et al. A mechanism for gene-environment interaction in the etiology of congenital scoliosis. Cell 149, 295-306 (2012).
29. Kumar, P., Henikoff, S. & Ng, P. C. Predicting the effects of coding non-synonymous variants on protein function using the SIFT algorithm. Nat Protoc 4, 1073-1081 (2009).
30. Ng, P. C. & Henikoff, S. Predicting deleterious amino acid substitutions. Genome Res 11, 863-874 (2001).
31. Adzhubel, I. A. et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nat Methods 7, 248-249 (2010).
32. Davis, R. L. & Turner, D. L. Vertebrate hairy and Enhancer of split related proteins: transcriptional repressors regulating cellular differentiation and embryonic patterning. Oncogene 20, 8342-8357 (2001).
33. Hirata, H. et al. Instability of Hes7 protein is crucial for the somite segmentation clock. Nat Genet 36, 750-754 (2004).
34. Lyons, L. A. et al. Whole genome sequencing in cats, identifies new models for blindness in AIPL1 and somite segmentation in HES7. BMC Genomics 17, 265 (2016).
35. Koressaar, T. & Remm, M. Enhancements and modifications of primer design program Primer3. Bioinformatics 23, 1289-1291 (2007).
36. Untergasser, A. et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res 40, e115 (2012).
37. Xu, X. et al. The genetic basis of white tigers. Curr Biol 23, 1031-1035 (2013).
38. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J 17, 10-12 (2011).
39. Li, H. & Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics 26, 589-595 (2010).
40. Li, H. et al. The sequence alignment/map format and SAMtools. Bioinformatics 25, 2078-2079 (2009).
41. Abecasis, G. R., Cherny, S. S., Cookson, W. O. & Cardon, L. R. Merlin-rapid analysis of dense genetic maps using sparse gene flow trees. Nat Genet 30, 97-101 (2002).

Благодарности

Мы благодарим д-ров С. Дж. О'Брайена и М. Менотти-Раймонд из Национального института рака, Фредерик, Мэриленд, за предоставление образцов породистых кошек, г-на Ю. Х. Танга из Южно-Китайского сельскохозяйственного университета за пожертвование самки с изогнутым хвостом для родословной кошек PKU, и всех владельцев кошек, которые любезно помогали в отборе образцов и/или поддержании родословной на протяжении всего проекта. Мы благодарны Р. Л. из Novogene Corporation, Пекин, за услуги секвенирования и ценные предложения. Это исследование было поддержано Центром наук о жизни Пекин-Цинхуа при Пекинском университете (CLS, через грант SJL) и Национальным фондом естественных наук Китая (NSFC № 31271320, 31471179 и 31200919).

Вклад авторов

X.X. и S.-J.L. разработали проект. Y.Z., Y.-C.L., H.M., H.Y. и L.M. внесли вклад в создание родословной кошек. X.X. выполнил эксперимент. X.X., X.S. и X.-S.H. выполнили биоинформатический анализ. X.X. и S.-J.L. написали рукопись. Все авторы прокомментировали рукопись и одобрили окончательную версию.

Дополнительная информация

Коды доступа: Данные ресеквенирования генома были депонированы в базе данных NCBI BioProject (PRJNA319449, SRP073776), под номерами доступа SRR3436305, SRR3436307, SRR3436357-3436366 и SRR3436368.

Дополнительная информация прилагается к этой статье по адресу https://www.nature.com/articles/srep31583

Конкурирующие финансовые интересы: Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Как цитировать эту статью: Xu, X. et al. Whole Genome Sequencing Identifies a Missense Mutation in HES7 Associated with Short Tails in Asian Domestic Cats. Sci. Rep. 6, 31583; doi: 10.1038/srep31583 (2016).

Эта работа лицензирована в соответствии с международной лицензией Creative Commons Attribution 4.0 International License. Изображения или другой сторонний материал в этой статье включены в лицензию Creative Commons статьи, если не указано иное в кредитной строке; если материал не включен в лицензию Creative Commons, пользователям потребуется получить разрешение от владельца лицензии на воспроизведение материала. Чтобы просмотреть копию этой лицензии, посетите http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/